包装系统密封性策略(三):微生物挑战法-浙江赛默制药有限公司.

无菌产品的容器密封系统应能防止微生物侵入。应当确保包装和贴签操作不对产品完整性引入风险（例如，包材或封口的损坏会影响包装的完整性）。确保包装系统能够充分保护产品，免受储存、运输和使用过程中可预见的外部因素导致的产品污染或变质（例如：运输中没有适当保护而导致破损的药瓶；包装袋的针孔式泄漏；无菌原料抗生素和大容量注射剂包装袋的针孔式泄漏；空运过程中压力变化引起的大规格无菌原料药铝罐胶圈脱落）。

上述关于无菌制剂的容器密封完整性检查(container–closure integrity test,CCIT)，需要对所选用的检测方法结合微生物挑战法,验证无菌药品密封完整性。根据USP1207的建议，包装系统最大允许泄漏限度（Maximum allowable leakage limit， MALL）根据不同的产品理化特性及微生物属性要求确定。当前CDE发布的征求意见稿，刚性包装可采纳的最大允许泄露限度为6×106mbar·L/s，相当于直径介于0.1~0.3μm的孔，此时微生物侵入的概率＜0.1。选择这个保守的最大允许泄露限度可确保较低风险的微生物侵入及液体泄露，可不进行用于表征漏洞尺寸的额外的微生物侵入或液体挑战研究。但其他包装系统（如采用柔性材料，或使用复杂冗长的密封接口），微生物侵入或液体泄露的风险还未明确。此时需要研究包装泄露与微生物侵入或液体泄露的风险，研究结果用于建立给定包装的最大允许泄露限度。

目前国内绝大部分情况下常见的确定性方法灵敏度都达不到上述MALL值，而评估密封性的效果是根据微生物挑战法来进行最小MALL值确定；所以USP会要求做大量的阳性瓶和阴性瓶测试并统计分析。CDE征求意见稿也建议至少采用两种方法（其中一种推荐微生物挑战法），目的是两种方法进行关联，研究拟采用CCIT方法与微生物挑战法对比LOD值是否能满足密封性检测的无菌要求。关于微生物挑战试验，《药品 GMP 指南无菌药品》中给出了实用性很强的技术指导。但之前申报品种仍有很多这方面的发补意见，涉及较多的是微生物挑战法建立时需关注的微生物种类、菌液浓度、培养基种类和暴露时间等。

微生物菌种选择

关于微生物菌种选择：微生物挑战的菌种选择对挑战结果至关重要。基本原则是要找尽可能小而易动（smal/motile），且在环境中常见的菌种进行挑战。USP127对挑战菌株选择依据描述为:小而具运动性,并提供了缺陷假单胞菌（0.5~0.8um）、黏质沙雷菌（0.5~1um）作为参考;2010版药品GMP指南（无菌制剂）的密封性测试中,描述了铜绿假单胞菌（0.5~1um）、大肠埃希菌（0.8~2um）、黏质沙雷菌（0.5~lum）作为挑战菌株。Goverde等人利用粘质沙雷氏菌(0.5-0.8×0.9-20um,ATCC14756）对已知孔径大小的西林瓶进行生物挑战,并在4um开始发现有细菌侵入。Moghimi用大肠杆菌和金黄色葡萄球菌对软包装进行了微生物气溶胶挑战实验,结果15um无微生物侵入,25um开始有少量侵入。Kirsch成功用缺陷假单胞菌和大肠杆菌的组合在0.2-0.3um的范围发现了微生物的入侵。上述菌株均为具有鞭毛运动能力的革兰阴性细菌, 对营养物质需求及培养条件均相似。所以目前一种体型较小的菌种和运动力强的杆菌的组合是微生物挑战法的一种新的思路。

黏质沙雷菌缺陷假单胞菌

大肠埃希菌铜绿假单胞菌

菌液浓度要求

关于菌液浓度：在浸泡挑战培养基中，微生物浓度应在整个挑战试验过程中达到适当的预定水平。药品GMP指南2010与USP1207中明确不小于10⁵CFU/ml，实际挑战浓度要更高。Sandle建议用10 ⁸CFU/ml作为菌液浓度，因为10 ⁶CFU/ml到10 ⁷CFU/ml，已经低于现在的普遍要求，Pinckney用了1.7x10 ⁹CFU/ml的菌量。

培养基要求

关于培养基要求：培养基种类应根据挑战菌株来选择，胰酪胨大豆培养基是一种常用的培养基。浸泡挑战培养基应允许特定挑战微生物充分生长,以便在阳性对照中检测到包装污染。每次进行浸入挑战试验时,培养基应进行营养试验，验证培养基的促菌生长能力是否合格。试样中介质的灌入量应足以确保每个潜在泄漏点处都有液体通道。必须有足够的体积和正确的包装顶空组成,以鼓励选定的挑战微生物的生长。当包装顶空的成分不包括氧气时,可采用其他试验条件（例如厌氧）。

试验条件

关于试验条件：参考USP 1207.2-3.2.3微生物挑战试验配备，在施加所需压差条件时,要保持悬浮液的均匀性和适当的温度。挑战菌悬液加入灭菌容器置于25℃恒温放置，浸没时间为4小时。要求在浸没过程中固定和/或定位包装的夹具。实验样品固定倒置于菌悬液中完全浸没。（见下图）